Realiza fotoativação simultânea multiponto

O módulo DMD permite a fotoativação e fotoconversão de um padrão e posição especificados pelo usuário, enquanto que uma unidade FRAP convencional somente permite a fotoativação de um único ponto posicionado manualmente. A forma, tamanho, posição e número da iluminação DMD podem ser personalizados livremente com o software NIS-Elements. Este recurso permite que os pesquisadores marquem de maneira óptica um subconjunto de populações de células ou proteínas, dentro de uma célula individual ou grupos de células, para acompanhar seu comportamento. O módulo DMD também é otimizado para experimentos de optogenética, onde ROIs altamente customizadas podem ser usadas para induzir opticamente alterações funcionais em subconjuntos de populações de células ou proteínas.  O módulo DMD pode ser usado tanto com iluminação laser como com iluminação LED, menos fototóxica.

Um fibroblasto embrionário de rato co-expressando lamina A marcada com mCherry (vermelho), e lamina A fotoativável marcada com GFP foi fotoconvertida (verde), na região inferior direita, usando o módulo DMD e luz de LED de 405 nm. As imagens por lapso de tempo foram capturadas com um iluminador de epifluorescência. Fotoativando uma subpopulação de proteínas lamina, pode-se observar sua dinâmica e comportamentos de trocas entre subunidades.

Imagem, cortesia dos Drs. Takeshi Shimi e Bob Goldman, Escola de Medicina da Universidade Northwestern

Agora, é possível o ajuste e a observação TIRF completamente automatizados

O ângulo de incidência e o foco do laser nas observações TIRF dependem do espécime e das condições de observação. O ajuste do ângulo de incidência e do foco para a realização de observações TIRF exige habilidade e experiência. O novo módulo H-TIRF ajusta automaticamente o foco e o ângulo de incidência do laser nas observações TIRF, através do monitoramento do raio refletido. Este ajuste automático do foco do laser e do ângulo de incidência é efetuado pela função de autoalinhamento do software NIS-Elements. Os ângulos de incidência e profundidades de penetração dos campos evanescentes podem ser salvos e reproduzidos em experimentos subsequentes para garantir a consistência dos resultados de captura de imagens.

O módulo H-TIRF module é configurado com um filtro de densidade neutra (ND) de gradação que pode ser deslocado para dentro do trajeto da luz para se obter um campo uniforme de iluminação TIRF.

Preparaçãoin vitrode microtúbulos marcados com fluorescência (tetrametilrodamina e Alexa 647) e proteínas de ligação de tubulina (Alexa 488) cuja imagem foi capturada em três comprimentos de onda diferentes com um iluminador H-TIRF e um filtro ND de gradação. Os ângulos de incidência podem ser ajustados automaticamente em diversos comprimentos de onda.

O vídeo desta imagem está na página. Imagens de amostra.

Imagem, cortesia de Melissa Hendershott e Dr. Ron Vale, Universidade da Califórnia, São Francisco

Sem o filtro ND de gradação, a iluminação TIRF apresenta um perfil gaussiano no Campo de Visão com o centro mais brilhante.

Com o uso do filtro ND de gradação, obtém-se uma iluminação TIRF muito uniforme.

Imagem de preparaçãoin vitrode uma membrana bilipídica contendo Alexa 488 (verde) e proteínas associadas a membrana marcadas com Alexa 561 (vermelho), capturada com uso do iluminador H-TIRF e dois comprimentos de onda diferentes (TIRF de duas cores). As proteínas se agregam para formar aglomerados, visualizados como estruturas circulares (na linha superior).

A linha inferior mostra os canais de 488 exibidos com o uso de uma tabela de busca arco-íris, onde intensidades diferentes são representadas por cores diferentes.

O iluminador H-TIRF pode ser usado para se obterem ângulos de incidência ótimos nos diversos comprimentos de onda.

Imagem, cortesia dos Drs. Xiaolei Su e Ron Vale, Universidade da Califórnia, São Francisco

Para análise da dinâmica de proteínas intracelulares

Com este módulo FRAP, é possível a realização de experimentos de fotodegradação e fotoativação/conversão com o uso de câmeras de alta sensibilidade e alta taxa de quadros. Este módulo consegue iluminar uma área alvo em uma célula, fornecendo um meio econômico para o estudo da dinâmica intracelular de proteínas, sem a necessidade de se usar um microscópio confocal de escaneamento de pontos. 

Um fibroblasto embrionário de rato expressando mCherry-lamina A fotodegradado em um área alvo, no canto direito superior do núcleo, com o módulo FRAP, para se estudar a dinâmica das moléculas de lamina A. As imagens por lapso de tempo foram capturadas com um iluminador de epifluorescência.

Imagem, cortesia dos Drs. Takeshi Shimi e Bob Goldman, Escola de Medicina da Universidade Northwestern

Para observação da dinâmica da membrana celular e de moléculas individuais.

O novo módulo TIRF manual inclui um filtro ND de gradação (similar ao do módulo H-TIRF), possibilitando até mesmo iluminação TIRF através do campo de visão. Com o uso de câmeras de alta sensibilidade, é possível capturar imagens de moléculas individuais e da dinâmica de proteínas na, ou próximo a, membrana celular, com o uso deste iluminador TIRF.

A modularidade e capacidade de configuração flexível do sistema Ti-Lapp oferecem soluções de imagem personalizadas para necessidades de pesquisa individuais. Os módulos podem ser facilmente adicionados ou trocados para adaptar o sistema a necessidades experimentais mutantes, sendo esta uma característica importante para laboratórios com direções de pesquisa em evolução e instalações com multiusuários. Por exemplo, ao adicionarem um segundo módulo TIRF a uma configuração de TIRF individual, os usuários serão capazes de realizar experimentos de anisotropia e experimentos TIRF multiângulo rápidos. A adição de um módulo de fotoativação/conversão, como o DMD ou FRAP, permite o rastreamento de uma fração de uma população de proteínas, o que permite a compreensão de comportamentos proteicos que passariam despercebidos na captura de imagens da população como um todo.

Aproveitando a estrutura estratificada Ti  da Nikon, os módulos podem ser incorporados em duas camadas separadas com vários módulos em cada camada. O uso de uma configuração em duas camadas permite uma configuração de filtros otimizada para cada módulo de iluminação. Por exemplo, colocando-se o módulo H-TIRF na camada inferior e um módulo DMD na camada superior, cubos de filtros separados, específicos para imagens TIRF e fotoativação, podem ser usados simultaneamente em suas respectivas torres de filtros, que também estão alojadas nas respectivas camadas inferior e superior. Esta configuração permite a seleção otimizada dos filtros e melhora a precisão nos experimentos, ao mesmo tempo em que mantém as maiores velocidades de aquisição.

Uma célula S2 de Drosófila expressando EOS-tubulina. A extremidade de um microtúbulo individual foi fotoconvertida com o uso do módulo DMD e luz LED de 405 nm. Imagens por lapso de tempo em TIRF de duas cores, adquiridas com o iluminador H-TIRF. A adição de tubulina verde não convertida a extremidade em crescimento do microtúbulo vermelho fotoconvertido, e o encolhimento (e eventual desaparecimento) do segmento fotoconvertido, demonstram a propriedade de instabilidade dinâmica dos microtúbulos. As pontas das setas indicam as extremidades em crescimento e em encolhimento do microtúbulo fotoconvertido.

Imagem, cortesia dos Drs. Nico Stuurman e Ron Vale, Universidade da Califórnia, São Francisco.